توليد آنتي باديهاي پلي كلنال و منوكنال بر ضد HBsAg و تخليص آنها جهت ساخت كيت تشخيص HBsAg به روش ELISA

نويسنده: رضا سلمان يزدي
استاد راهنما: محمد فرهادي لنگرودي
استاد مشاور: سيدحسين شمس
تاريخ دفاع: 1376/07/01
مدرك: دكترا علوم آزمايشگاهي تشخيص طبي
دانشگاه: دانشگاه علوم پزشكي ايران، پيراپزشكي،
چكيده: اين مطالعه قسمتي از يك پروژه توليدي است كه هدف غايي آن توليد كيتهاي تشخيصي HBsAg با روش ELISA مي باشد. هدف از اين مطالعه توليد معرفهاي آنتي بادي پلي كلنال و منوكلنال بر ضد HBsAg و تخليص آنها بوده، به نحوي كه بتوان از آنها بعنوان معرفهاي بيولوژيك اوليه در توليد كيتهاي ELISA براي تشخيص HBsAg بهره برداري نمود. براي توليد Anti-HBs دو نوع ايمونوژن مورد استفاده قرار گرفته است كه يكي واكسن HBsAg توليد شده با تكنيك DNA نوتركيب بوده و ديگري HBsAg تخليص شده از پلاسماهاي افراد مبتلا به فرم ناقل هپاتيت B مي باشد كه با استفاده از روش كروماتوگرافي جذبي بدست آمده است. براي توليد آنتي بادي پلي كلنال از دو حيوان خرگوش و گوسفند استفاده گرديده كه براي ايمونيزاسيون خرگوش از واكسن و براي ايمونيزاسيون گوسفند از HBsAg بدست آمده از پلاسما استفاده شده است. براي جداسازي آنتي بادي از سرم حيوانات از روشهاي رسوب با سولفات آمونيوم اشباع و كروماتوگرافي تعويض يوني DEAE استفاده شده است. براي توليد آنتي بادي منوكلنال از موش Balb/c استفاده گرديده كه پس از ايمونيزاسيون، سلولهاي طحالي موش ايمن شده بوسيله تكنيك cell fusion با استفاده از پلي اتيلن گليكول (PEG) با سلول ميلومايي P3X63Ag8.G653 ممزوج گرديده است. براي غربالگري هيبريدوماهاي حاصله از كيت تشخيص Anti-HBs به روش ElISA استفاده گرديده است. از امتزاج هاي انجام شده 5 كلون حاصل گرديده كه 4 كلون Anti-HBs از كلاس IgM ترشح مي كنند. براي توليد انبوه آنتي بادي منوكلنال از روش in vivo و با ايجاد آسيت در موش Balb/c پس از انجام priming با pristane و ادجوانت ناكامل فروند استفاده گرديده است. براي جداسازي آنتي بادي منوكلنال از آسيت موش نيز از روشهاي رسوب با سولفات آمونيوم اشباع و كروماتوگرافي تعويض يوني DEAE استفاده شده است. جهت كنترل كيفي و تعيين خلوص آنتي باديهاي حاصله از روشهاي اندازه گيري كمي Anti-HBs با تكنيك ELISA و الكتروفورز پروتئينها استفاده گرديده است. نتايج حاصله نشانگر اين بوده است كه با استفاده از واكسن در خرگوش ميزان Anti-HBs حداكثر تا IU/Lit100000 افزايش يافته و با استفاده از HBsAg تخليص شده از پلاسما درگوسفند ميزان Anti-HBs تا IU/Lit5000000 افزايش نشان داده است. بعلاوه با استفاده از روشهاي گفته شده براي تخليص IgG از سرم فراكسيون IgG با خلوص مناسب از سرم بدست آمده كه مي توان از آن براي استفاده در تستهاي ELISA بهره برداري نمود. همچنين نشان داده شده است كه ميزان آنتي بادي منوكلنال اختصاصي در فراكسيون IgG بدست آمده از آسيت موش داراي درجه خلوص 95-90% مي باشد كه اين مساله مي تواند يك مزيت بسيار مهم براي اين آنتي باديها جهت استفاده از آنها بعنوان معرفهاي ايمونولوژيك محسوب گردد.
كلمات كليدي: