مطالعه پاسخهاي ايمني همورال بر عليه توكسين كزاز در انسان و موش در مقياس تك سلولي

نويسنده: مهدي يوسفي
استاد راهنما: فاضل شكري
استاد مشاور: سيد عليرضا رضوي، محمود جدي تهراني، حجت الله رباني
تاريخ دفاع: 1391/06/04
مدرك: دكتري تخصصي ايمونولوژي پزشكي
دانشگاه: علوم پزشكي وخدمات بهداشتي درماني تهران، بهداشت، پاتوبيولوژي
چكيده: مقدمه: كزاز يك بيماري بسيار كشنده و با مرگ و مير بالا در جوامع بشري به ويژه كشورهاي در حال توسعه است كه به واسطه نوروتوكسين كلستريديوم تتاني ايجاد مي‌شود. تتانوس نوروتوكسين يك پلي پپتيد 150 كيلو دالتوني است كه از يك زنجيره سبك(Light chain)
50كيلو دالتوني و يك زنجيره سنگين(Heavy chain) ، صد كيلودالتوني تشكيل شده است. زنجيره سبك، بخش توكسيك نوروتوكسين كلستريديوم تتاني است در حاليكه زنجيره سنگين در اتصال و ترانس لوكاسيون توكسين نقش دارد. زنجيره سنگين خود از دو بخش تقريبا يكسان 50 كيلودالتوني شامل انتهاي آميني زنجيره سنگين يا HN و انتهاي كربوكسيلي زنجيره سنگين يا HC تشكيل شده است كه ناحيه HC اصطلاحا قطعه C يا فراگمنت C نيز ناميده مي‌شود. فراگمنت C خود از دو بخش تشكيل شده است: HCN يا انتهاي آميني فراگمنت C و HCC يا انتهاي كربوكسيلي فراگمنت C كه ساب دومين HCC فراگمنت C نقش اصلي را در اتصال توكسين كزاز به گيرنده هايش در سطح سلول‌هاي نوروني دارد.
سيستم ايمني همورال و آنتي بادي‌ها نقش اصلي را در خنثي كردن توكسين كزاز دارند. با وجود توليد آنتي بادي‌هاي متعدد انساني و موشي بر عليه توكسين كزاز هنوز هم ابهامات بسيار زيادي در ارتباط با نواحي ايمونودوميننت و ايمونوپروتكتيو توكسين كزاز، تفاوت پاسخ‌هاي ايمني همورال در انسان و موش و نيز نحوه اتصال توكسين به گيرنده‌اش وجود دارد. بر همين اساس در اين پايان نامه با توليد تعداد بسيار زيادي از آنتي بادي‌هاي انساني و موشي براي اولين بار بررسي جامع و كاملي در سطح كلونال بر روي پاسخ‌هاي ايمني همورال در انسان و موش و نيز مقايسه اين دو سيستم در نحوه پاسخ به توكسين كزاز انجام شد.
روشها: در اين مطالعه با استفاده از تكنيك هيبردوما و ترانسفورماسيون لنفوسيت B انسان با ويروس EBV به ترتيب آنتي بادي‌هاي مونوكلونال موشي و آنتي‌بادي‌هاي انساني توليد شد و سپس ويژگي‌هاي ساختاري و عملكردي اين آنتي بادي‌ها با استفاده از تكنيك‌هاي مختلف نظير الايزا، ايمونوبلاتينگ، تعيين توالي نوكلئوتيدي ژنهاي VH و VL و آزمون‌هاي خنثي سازي توكسين در محيط in vitro و in vivo مورد بررسي قرار گرفت. قدرت خنثي‌كنندگي توكسين در in vitro از طريق مهار اتصال توكسين به گانگليوزيدي سري GT1b)1b ) و در in vivo از طريق مهار كشندگي توكسين در موش‌هاي BALB/c مورد مطالعه قرار گرفت. همچنين دو بخش اصلي توكسين كزاز (زنجيره سبك و ساب دومن HCC) به صورت نوتركيب و با استفاده از سيستم پروكاريوتي و وكتور (+)pET28b توليد و تخليص گرديد و همراه با توكسين و توكسوئيد كزاز و فراگمنت C تجاري جهت مطالعه ويژگي آنتي‌ بادي‌هاي مورد استفاده قرار گرفتند.
نتايج: در اين مطالعه تعداد 22 كلون هيبريدوم توليد كننده آنتي بادي مونوكلونال موشي و 50 رده لنفوسيت B ترانسفورم شده با EBV مولد آنتي بادي انساني ضد تتانوس توكسين توليد شدند. همچنين پروتئين‌هاي نوتركيب زنجيره سبك و ساب دومن HCC در سيستم پروكاريوتي توليد و تخليص شدند. بررسي ويژگي‌هاي اين آنتي بادي‌ها با زنجيره سبك، فراگمنت C و ساب دومن HCC نشان داد كه در انسان عمده آنتي بادي‌ها بر عليه فراگمنت(C) برابر 68% بوده در حاليكه در موش تنها 31.8% آنتي بادي‌ها بر عليه اين بخش مي‌باشند. نكته بسيار مهم ديگر اين است كه در انسان آنتي بادي‌هاي خنثي كننده در شرايط in vitro عمدتا بر عليهHCC ويژگي دارند (6 آنتي بادي از 8 آنتي بادي خنثي كننده) در حاليكه در موش از 6 آنتي بادي خنثي كننده در شرايط in vitro فقط يك آنتي بادي بر عليه اين ساب دومن بود. وجه مشترك پاسخ‌هاي ايمني همورال در انسان و موش ايمونوپروتكتيو بودن فراگمنت C است كه در موش تمام آنتي بادي‌هاي خنثي كننده و در انسان 75% آنتي بادي‌هاي خنثي كننده ضد اين بخش از توكسين بودند. در ادامه اين مطالعه قدرت خنثي كنندگي توكسين كزاز توسط آنتي‌بادي‌هاي موشي در شرايط in vivo مورد بررسي قرار گرفت. نتايج نشان داد كه از تعداد 6 آنتي بادي منوكلونالي كه در شرايط in vitro توكسين را خنثي مي‌كنند، تعداد 3 آنتي بادي قدرت خنثي كنندگي در شرايط in vivo را نيز دارند ضمن اينكه 2 آنتي بادي سبب تاخير چند روزه در مرگ موش‌ها مي‌شدند. يك آنتي بادي هم فاقد اين توانايي مي‌باشد. آنتي بادي اخير مي‌تواند با آنتي بادي‌هاي گروه اول اثرات سينرژيك قوي در خنثي سازي توكسين در in vivo داشته باشد. هيچ يك از آنتي بادي‌هايي كه فاقد قدرت خنثي كنندگي در in vitro بودند توانايي خنثي كنندگي در آزمون in vivo را نداشتند. تعيين توالي ژنهاي VH و VL آنتي بادي‌ها نشان داد كه همه آنتي بادي‌ها، به استثناء سه آنتي بادي كه داراي قدرت خنثي كنندگي توكسين در in vivo بودند، داراي منشا كلونال مستقلي هستند.
نتيجه گيري: اين پايان نامه اولين مطالعه در نوع خود مي‌باشد كه در آن پاسخ‌هاي ايمني همورال را در انسان و موش نسبت به توكسين كزاز مورد بررسي و مقايسه قرار داده است. نتايج ما نشان داد كه فراگمنت C توكسين كزاز يك ناحيه ايمونودوميننت و ايمونوپروتكتيو در انسان و موش بوده و مي‌تواند به عنوان كانديدي براي واكسيناسيون كزاز مطرح باشد. همچنين نتايج ما نشان داد كه فراگمنت C داراي دومن‌هاي مختلفي بوده كه هر كدام از اين دومن‌ها در اتصال به گيرنده هاي توكسين كزاز نقش دارند و اتصال آنتي بادي‌ها به اين بخش‌هاي مختلف در خنثي سازي كامل نتانوس توكسين نقش بسيار مهمي دارد.
كلمات كليدي: كزاز، نوروتوكسين كلستريديوم تتاني، آنتي بادي مونوكلونال موشي، پاسخ ايمني همورال، خنثي سازي تتانوس توكسين، فراگمنت C، ويروس اپشتاين بار، ترانسفورماسيون لنفوسيت B