مطالعه پاسخهاي ايمني ذاتي و اكتسابي به آنتي ژنهاي اصلي و ايمني زاي باكتري بوردتلا پرتوسيس

نويسنده: حسين عسگريان عمران
استاد راهنما: علي اكبر اميرزرگر، فاضل شكري
استاد مشاور: بهروز نيك بين مقدم، محمود جدي تهراني، حجت الله رباني، سعيد اشراقي
تاريخ دفاع: 1391/04/01
مدرك: دكتراي تخصصي ايمونولوژي پزشكي
دانشگاه: علوم پزشكي وخدمات بهداشتي درماني تهران، پزشكي، ايمونولوژي
چكيده: مقدمه: واكسيناسيون عليه سياه سرفه در دهه 1950 ميلادي با استفاده از واكسنهاي حاوي پيكره كامل باكتري غير فعال شده (whole cell vaccines-Wc) شروع شده و موجب كاهش شديد موارد ابتلا به بيماري گرديد. عوارض جانبي ناشي از واكسنهاي Wc كه بخصوص در نوزادان و كودكان قابل ملاحظه بود، موجب معرفي نسل جديدي از واكسنهاي سياه سرفه تحت عنوان واكسنهاي غير سلولي (acellular vaccines-Ac) گرديد كه حاوي چند آنتي ژن اصلي و ايمني زاي باكتري از جمله توكسين سياه سرفه (pertussis toxin-PT)، هماگلوتينين رشته‌اي (Filamentous hemagglutinin-FHA) و پرتاكتين (pertactin-PRN) مي‌باشند. اگرچه در حال حاضر بسياري از كشورهاي پيشرفته دنيا از واكسنهاي Ac در برنامه ايمونيزاسيون كشوري استفاده مي‌كنند، ولي كماكان در اغلب كشورهاي در حال توسعه از واكسنهاي سنتي Wc استفاده مي‌گردد كه مهمترين دليل آن هزينه بالاي توليد و خالص سازي آنتي ژنهاي واكسنهاي Ac مي‌باشد.
در اين مطالعه آنتي ژنهاي ايمني زاي PT، FHA و PRN بصورت طبيعي و نوتركيب تخليص، توليد و تعيين خصوصيت شده و سپس پاسخهاي ايمني ذاتي و اكتسابي انسان در محيط in vitro عليه اين آنتي ژنها در كنار آنتي ژنهاي تجاري به عنوان كنترل بررسي شد.
روشها: خالص سازي پروتئينهاي طبيعي PT، FHA و PRN از سوپرناتانت محيط كشت مايع بوردتلا پرتوسيس با استفاده از روشهاي مختلف كروماتوگرافي صورت گرفت. همچنين 9 آنتي ژن نوتركيب مربوط به بخشهاي مختلف آنتي ژنهاي PT (rPTA، rPTB و rPTC)، FHA (rFHA1-4) و PRN (rPRN1 و rPRN2) در سيستم پروكاريوتي توليد شده و با استفاده از ستونهاي كروماتوگرافي شناسايي كننده His-tag و ژل فيلتراسيون تخليص شدند. از آزمونهاي SDS-PAGE، وسترن بلات و ELISA براي مطالعه ساختار پروتئينهاي تخليص شده استفاده شد.
در ارتباط با بررسي پاسخ ايمني ذاتي، توانايي آنتي ژنهاي مختلف طبيعي و نوتركيب PT، FHA و PRN در تحريك گيرنده‌هاي مختلف شبه تول (Toll-like receptors-TLRs) سطحي بررسي شد. براي اين منظور از سلولهاي HEK293 ترانسفكت شده با TLR2، TLR4 و TLR5 انساني بهره گرفته شده و تحريك گيرنده‌هاي TLR مربوطه نيز از طريق اندازه‌گيري فعاليت ژن گزارشگر NF-kB و همچنين سنجش سيتوكاين پيش التهابي IL-8 در سوپرناتانت كشت سلولهاي تحريك شده با آنتي ژن پايش شد.
براي بررسي پاسخ ايمني اكتسابي نيز ابتدا 25 فرد بالغ سالم داوطلب با يك دوز از واكسن تجاري Ac سياه سرفه حاوي آنتي ژنهاي PT، FHA و PRN واكسينه شدند. نمونه خون محيطي هپارينه از داوطلبين پيش از واكسيناسيون و در زمانهاي يك هفته و چهار هفته پس از واكسيناسيون جهت جداسازي سلولهاي تك هسته‌اي خون محيطي (PBMCs) اخذ شد. پاسخ تكثيري سلولهاي PBMC نمونه هاي قبل و بعد از واكسيناسيون به آنتي ژنهاي PT، FHA و PRN نوتركيب از طريق جذب تيميدين راديو اكتيو بررسي شد. همچنين غلظت سيتوكاين IFN-γ در سوپرناتانت كشت سلولي به عنوان نمادي از تحريك سلولهاي Th1 با روش ساندويچ ELISA اندازه گيري شد.
نتايج:
آنتي ژنهاي PT و FHA بصورت طبيعي و با استفاده از ستونهاي كروماتوگرافي جذبي حاوي آنتي بادي پلي كلونال ضد آنتي ژنها از سوپرناتانت كشت مايع بوردتلا پرتوسيس با موفقيت تخليص شد. خالص سازي آنتي ژن PRN طبيعي با نتايج مطلوبي همراه نبوده است. توالي كد كننده مربوط به تمامي 9 پروتئين نوتركيب مورد مطالعه از ژنوم باكتري تكثير شده، در وكتور كلونينگ pGEMT-easy كلون شده و پس از تأييد تعيين توالي با موفقيت به وكتور بياني pET22b(+) انتقال يافتند. پروتئينهاي نوتركيب در سوشهاي مختلف E-coli در مقادير فراوان بيان شده و با استفاده از ستونهاي كروماتوگرافي شناسايي كننده His-tag و ژل فيلتراسيون با موفقيت تصفيه شدند.
نتايج حاصل از تحريك سلولهاي HEK293 ترانسفكت شده با گيرنده هاي TLR نشان داد كه PT موجب تحريك گيرنده هاي TLR2 و TLR4 شده و همچنين براي اولين بار نشان داده شد كه FHA يك محرك قوي مسير TLR2 مي‌باشد. با بكارگيري آنتي ژنهاي نوتركيب FHA توليد شده در اين پروژه مشخص شد كه ناحيه اتصال به TLR2 در مولكول بزرگ FHA در حد فاصل بين اسيد آمينه‌هاي 1917-1544 (rFHA2) قرار دارد و از ميان پروتئينهاي نوتركيب FHA تنها rFHA2 قادر به تحريك مسير TLR2 مي‌باشد. هيچ يك از آنتي ژنهاي PT، FHA و PRN موجب تحريك سلولهاي HEK293 ترانسفكت شده با TLR5 نشدند. آنتي ژنهاي PT و FHA خالص شده نتايج مشابهي را در ارتباط با تحريك گيرنده هاي TLR در مقايسه با همتاي تجاري خود نشان دادند.
نتايج بدست آمده از پاسخ تكثيري سلولهاي PBMC و ترشح IFN-γ در سوپرناتانت كشت سلولي نمونه هاي قبل و بعد از واكسيناسيون با آنتي ژنهاي طبيعي و نوتركيب سياه سرفه نشان دهنده افزايش پاسخ تكثيري به اغلب آنتي ژنها در نمونه هاي بعد از واكسيناسيون در مقايسه با نمونه هاي قبل از واكسيناسيون بوده كه خود نمادي از فعال شدن سيستم ايمني سلولي مي‌باشد. از ميان آنتي ژنهاي آزمون شده تنها آنتي ژن نوتركيب rPRN2 قادر به القاي پاسخ تكثيري سلولهاي PBMC و ترشح IFN-γ در آنها نبود. آنتي ژنهاي PT و FHA تصفيه شده مورد استفاده در اين آزمونها نتايج مشابهي را در مقايسه با آنتي ژنهاي تجاري نشان دادند.
نتيجه گيري: در مجموع يافته هاي اين مطالعه در ارتباط با فعال شدن مسيرهاي TLR2 و TLR4 توسط آنتي ژن PT و بويژه تحريك قوي مسير TLR2 توسط آنتي ژن FHA كه براي اولين بار در اين مطالعه نشان داده شده است، دلالت بر نقش اين آنتي ژنها در فعالسازي پاسخ ايمني ذاتي ميزبان در عفونت سياه سرفه مي‌باشد. همچنين با معرفي آنتي ژن نوتركيب rFHA2 به عنوان يك محرك قوي TLR2 و در ادامه نقش اين آنتي ژن در تحريك سلولهاي Th1، به نظر مي‌رسد كه اين آنتي ژن احتمالاً مي‌تواند به عنوان يك جايگزين مناسب در تركيب واكسنهاي غير سلولي مورد استفاده قرار گيرد. از آنجا كه مطالعات پاسخ تكثيري و ترشح IFN-γ در نمونه هاي محدودي انجام شده است، لذا معني دار بودن نتايج بدست آمده و تحريك پاسخهاي Th1 توسط اغلب آنتي ژنهاي طبيعي و نوتركيب بسيار نويدبخش مي‌باشد. با تكميل مطالعات ايمني زايي آنتي ژنهاي طبيعي و بخصوص نوتركيب توليد شده و همچنين بررسي قدرت القاي پاسخ هومورال و خصوصيات حفاظت بخشي اين آنتي ژنها در مدل موشي سياه سرفه ميتوان از آنها به عنوان جايگزين مناسبي براي تركيب واكسنهاي غير سلولي سياه سرفه استفاده نمود.
كلمات كليدي: سياه سرفه، بوردتلا پرتوسيس، واكسيناسيون، پروتئين نوتركيب، ايمني ذاتي، گيرنده شبه تول (TLR)، ايمني اكتسابي