بررسي تعداد و عملكرد لنفوسيتهاي T تنظيمي (Tregs) در بيماران مبتلا به نقص ايمني شايع متغير (CVID)

نويسنده: نرگس ارندي فروشاني
استاد راهنما: عباس ميرشفيعي، اصغر آقامحمدي
استاد مشاور: محمود جدي تهراني، عبدالفتاح صراف نژاد
تاريخ دفاع: 1391/11/01
مدرك: دكتري تخصصي ايمونولوژي پزشكي
دانشگاه: علوم پزشكي وخدمات بهداشتي درماني تهران، بهداشت، ايمونولوژي
چكيده: نقص ايمني شايع متغير (CVID)، شايعترين نقص ايمني اوليه علامتدار است كه به صورت مجموعه هتروژني از ناهنجاريهاي مختلف بروز پيدا مي‌كند. مشخص‌ترين ويژگي بارز بيماري، نقص در مراحل تمايز لنفوسيتهاي B و تبديل آنها به plasma cell و توليد آنتي بادي توسط اين سلولها و متعاقب آن افزايش استعداد ابتلا به عفونتهاي مكرر باكتريايي خصوصا در دستگاه تنفس فوقاني مي‌باشد. ساير تظاهرات غير عفوني مثل التهابات مزمن همراه با گرانولوما، بدخيمي‌ها و همچنين بيماريهاي خود ايمن نيز در اين بيماران شايع مي‌باشد. لنفوسيتهايT تنظيمي CD4+CD25+FOXP3+ زير گروهي از لنفوسيت‌هايT تنظيمي هستند كه نقش كليدي در حفظ تولرانس به آنتي ژنهاي خودي و ايجاد پاسخ ايمني بر عليه انتي ژنهاي خودي و بيگانه دارند و براي جلوگيري از ايجاد پاسخهاي ايمني مخرب توسط تكثيرلنفوسيتهاي خودواكنشگر، بسيار مهم هستند. با توجه به اين مساله كه در تعدادي از بيماران CVID تظاهرات خود ايمن بروز پيدا مي‌كند، به نظر مي‌رسد كه نقص احتمالي در لنفوسيت‌هاي T تنظيمي، در ايجاد اختلال در تنظيم پاسخ ايمني در بيماران CVID و بروز تظاهرات باليني خصوصاً بيماريهاي خودايمن در اين افراد تاثير گذار باشد.
در اين مطالعه، فراواني، عملكرد مهاري لنفوسيت‌هاي T تنظيمي و بيان فاكتور نسخه برداري FOXP3 در بيماران CVID مبتلا به تظاهرات خود ايمن، بيماران فاقد تظاهرات خود ايمن، بيماران ITP بعنوان گروه كنترل مثبت داراي بيماري خودايمن و گروه كنترل سالم مورد بررسي قرار گرفت. بعلاوه براي اولين بار، ميزان بيان ماركرهاي سطحيCTLA-4 و GITR كه مرتبط با فعاليت مهاري لنفوسيت‌هاي T تنظيمي هستند، در سطح mRNA و نيز ميزان سيتوكينهايIL-10 و TGF-β كه نقش تنظيم سيستم ايمني را دارند، در محيط كشت حاوي لنفوسيت‌هاي T تنظيمي اندازه‌گيري شد. بدين منظور، 37 بيمارCVID ، 20 بيمار ITP بعنوان گروه كنترل مثبت داراي بيماري خود ايمن و 20 فرد سالم به عنوان گروه كنترل فراخوانده شدند. ابتدا سلولهاي تك هسته‌اي خون محيطي (PBMCs) جدا شده و با كمك روش فلوسيتومتري، فراواني لنفوسيتهاي T تنظيمي و ميزان بيان فاكتور نسخه برداري FOXP3 بر اساس شدت فلورسنس آن (MFI) در خون محيطي افراد تعيين شد. به منظور بررسي عملكرد لنفوسيت‌هاي T تنظيمي، با كمك روش جدا سازي سلول با استفاده از دانه هاي مغناطيسي (MACS) لنفوسيت‌هاي T تنظيمي جدا شدند و در محيط كشت درصد مهار تكثير لنفوسيت‌هاي T پاسخ دهنده (Tres) توسط لنفوسيت‌هاي T تنظيمي با استفاده از كيت اليزاي حاوي BrdU محاسبه گرديد. از آنجا كه سيتوكين‌هاي IL-10 و TGF-β دو سيتوكين مهم تنظيم كننده سيستم ايمني هستند و احتمالاً در فعاليت مهاري لنفوسيت‌هاي T تنظيمي نقش دارند، ميزان آنها در محيط كشت حاوي لنفوسيت‌هاي T پاسخ دهنده (Tres) و لنفوسيت‌هاي T تنظيمي با روش اليزا اندازه گيري شد. به منظور محاسبه ميزان بيان mRNA ژنهاي CTLA-4 و GITR كه مرتبط با فعاليت مهاري لنفوسيت‌هاي T تنظيمي هستند، كل RNA سلولي استخراج شده و ميزان بيان mRNA اين ژنها با استفاده از روش Real-Time TaqMan PCR اندازه گيري شد. نتايج نشان داد كه فراواني لنفوسيت‌هاي T تنظيمي، در بيماران CVID كاهش كاملاً معني داري در مقايسه با گروه كنترل سالم پيدا كرده است (0.72± 1.81 در مقابل1.07 ±3.57؛ P<0.001). بر اساس 2 انحراف معيار (SD) كمتر از فراواني لنفوسيت‌هاي T تنظيمي در گروه كنترل سالم، يك حد مرزي (cutoff point) با مقدار % 1.43 براي لنفوسيت‌هاي T تنظيمي تعيين شد و بيماراني كه فراواني لنفوسيت‌هاي T تنظيمي انها كمتر از اين مقدار بود، بعنوان بيماراني كه لنفوسيت‌هاي T تنظيمي آنها كم است، تلقي شدند. همانطور كه انتظار مي‌‌رفت، فراواني لنفوسيت‌هاي T تنظيمي در بيماراني كه لنفوسيت‌هاي T تنظيمي آنها كم است در مقايسه با بيماراني كه لنفوسيت‌هاي T تنظيمي آنها نرمال است، كاهش معني داري يافته بود (0.28± 1.0 در مقابل 0.55 ±2.18؛ P<0.001). زماني كه بيماران CVID بر اساس فنوتيپهاي باليني تقسيم بندي شدند، مشاهده گرديد كه در بيماران داراي تظاهرات خودايمن، فراواني لنفوسيت‌هاي T تنظيمي به طور معني داري در مقايسه با گروه فاقد بيماري خود ايمن كاهش يافته است (0.64± 1.5 در مقابل 0.7 ±2.04؛ P=0.023). آناليز بررسي فراواني لنفوسيت‌هاي T تنظيمي در مورد بيماران ITP نشان داد كه مشابه بيماران CVID، فراواني لنفوسيت‌هاي T تنظيمي در بيماران ITP در مقايسه با گروه كنترل سالم كاهش معني داري يافته است (0.6±1.6 در مقابل 1.07±3.57، P<0.001). مشابه فراواني لنفوسيت‌هاي T تنظيمي، ميزان بيان پروتئين FOXP3 بر اساس شدت فلورسنس آن (MFI) در خون محيطي بيماران CVID كاهش كاملاً معني داري در مقايسه با گروه كنترل سالم پيدا كرده بود (0.52± 2.91 در مقابل 0.98 ±3.83؛P<0.001). ميزان MFI پروتئين FOXP3 نيز در بيماراني كه لنفوسيت‌هاي T تنظيمي آنها كم است در مقايسه با بيماراني كه لنفوسيت‌هاي T تنظيمي آنها نرمال است، كاهش معني داري يافته بود (0.45± 2.66در مقابل 0.54 ±3.1؛ P=0.02). همانند فراواني لنفوسيت‌هاي T تنظيمي، ميزان MFI پروتئين FOXP3 در بيماران داراي تظاهرات خودايمن، به طور معني داري در مقايسه با گروه فاقد بيماري خودايمن كاهش يافته است (0.39± 2.64 در مقابل 0.52 ±3.15؛ P=0.002). در مورد ميزان MFI مولكول FOXP3 در بيماران ITP نيز مشاهده شد كه مشابه بيماران CVID، ميزان بيان FOXP3 در مقايسه با گروه كنترل سالم كاهش معني داري يافته است (0.57 ± 2.6 در مقابل 0.98 ± 3.83، P<0.001). نتايج نشان دادند كه ميزان عملكرد مهاري لنفوسيت‌هاي T تنظيمي در بيماران CVIDدر مقايسه با گروه كنترل سالم كاهش معني داري (2 برابر) يافته است (5.5 ± 20.15 در مقابل 7.13± 40.08، P<0.001). اندازه گيري ميزان توليد سيتوكينهاي IL-10 و TGF-β در كشت همزمان لنفوسيت‌هاي T پاسخ دهنده (Tres) و لنفوسيت‌هاي T تنظيمي نشان داد كه توليدIL-10 به ميزان قابل توجهي (3.2 برابر) در بيماران CVID در مقايسه با گروه كنترل سالم كاهش يافته است (77.7 ± 110.8 در مقابل 286.2 ± 355.1 pg/ml ، P=0.007). عليرغم كاهش ميزان TGF-β در بيماران CVID در مقايسه با گروه كنترل سالم، تفاوت معني داري در ميزان توليد آن بين اين دو گروه ديده نشد (37.8± 59.7 در مقابل 36.9 ± 85.5 pg/ml ، P=0.09). مشابه بيماران CVID، در مورد بيماران ITP نيز مشاهده گرديد كه فعاليت مهاري لنفوسيت‌هاي T تنظيمي در بيماران ITP در مقايسه با گروه كنترل سالم نيزكاهش معني‌داري (2 برابر) يافته است (2.6 ±20.1 در مقابل 13.7± 40.08، P<0.001). همچنين ميزانIL-10 به ميزان قابل توجهي (3.1 برابر) در بيماران ITP در مقايسه با گروه كنترل سالم كاهش يافته است (56.7 ± 113.8 در مقابل 286.2 ±355.1 pg/ml، P=0.02). در مورد ميزان توليدTGF-β در بيماران ITP نيز، كاهش معني داري (1.8 برابر) در مقايسه با گروه كنترل سالم ديده شد (10.38 ±46.11 در مقابل 36.9 ± 85.5 pg/ml،P=0.01). آناليز نتايج حاصل از Real-time PCR در مورد ميزان بيان mRNA ژنهاي CTLA-4 و GITR نشان داد كه هر دو اين ژنها CTLA-4) به ميزان 3.8 برابر و GITR به ميزان 3.7 برابر) در بيماران CVIDدر مقايسه با گروه كنترل سالم كاهش قابل ملاحظه‌اي يافته‌اند (به ترتيب P=0.005 و P<0.001). اگر چه، هيچ تفاوت معني داري در مورد بيان اين دو ژن بين بيماران CVID داراي بيماري خودايمن و بيماران فاقد تظاهرات خود ايمني ديده نشد (به ترتيب P= 0.82و P=0.23). در مورد بيماران ITP مشاهده گرديد كه مشابه بيماران CVID، ميزان بيان mRNA ژنهاي CTLA-4 و GITR CTLA-4) به ميزان 3.4 برابر و GITR به ميزان 4 برابر) در بيماران ITP در مقايسه با گروه كنترل سالم كاهش قابل ملاحظه‌اي يافته‌اند (به ترتيب P= 0.02و P=0.006).
بطور خلاصه نتايج اين مطالعه نشان داد كه فراواني لنفوسيت‌هاي T تنظيمي و عملكرد مهاري آنها در بيماران CVID خصوصاً افراد داراي تظاهرات خودايمن، به طورمشابه با بيماران ITP دچار اختلال مي‌باشد. همچنين، ميزان بيان مولكول FOXP3 و ماركرهاي سطحي CTLA-4و GITR و سطح سيتوكينهاي IL-10 و TGF-β كه مرتبط با عملكرد مهاري لنفوسيت‌هاي T تنظيمي هستند، در اين بيماران به طورمشابه با بيماران ITP كاهش مي‌يابد. بنابراين، مي‌توان نتيجه گيري كرد كه اين اختلالات مي‌توانند مسئول شكل گيري پاسخهاي ايمني ناكارامد در بيماران CVID كه يكي از پيامدهاي مهم آن افزايش بروز بيماريهاي خودايمني در اين بيماران است، باشد.


كلمات كليدي: لنفوسيتهاي T تنظيمي، نقص ايمني شايع متغير، خود ايمني، عملكرد مهاري، مولكول FOXP3، ماركرهاي سطحي