بررسي نقش (Endoplasmic Reticulum Aminopeptidase 1 (ERAP1 در ايمونوپاتوژنز بيماري اسپونديليت آنكيلوزان

نويسنده: مهدي محمودي
استاد راهنما: محمد‌حسين نيكنام
استاد مشاور: علي‌اكبر اميرزرگر، احمد‌رضا جمشيدي، كرامت نوري‌جلياني
تاريخ دفاع: 1391/03/01
مدرك: دكتراي تخصصي ايمونولوژي
دانشگاه: علوم پزشكي وخدمات بهداشتي درماني تهران، پزشكي،
چكيده: بيان مسئله:بيماري اسپونديليت آنكيلوزان (AS) يك بيماري التهابي مزمن با علت ناشناخته و زيرگروه اصلي يك دسته از بيماري‌هاي روماتيسمي است كه تحت عنوان اسپونديلوآرتروپاتي ها از آن ياد مي شود و با HLA-B27 همراهي قابل توجهي دارد. اين بيماري بطور معمول با التهاب در سطح غضروف - استخوان و عمدتاً در مفصل ساكروايلياك شروع مي شود و سپس در مراحل بعدي، اسكلت محوري (ستون فقرات) را درگير مي كند كه اين درگيري مي-تواند به صورت اسپونديليت، اسپونديلوديسكيت و آرتريت مفاصل كوچك بين مهره‌اي باشد. متعاقب التهاب، استخوان-سازي جديد در بخش‌هاي درگير اتفاق مي افتد كه تعيين كننده اصلي محدوديت در حركت ستون فقرات، محدود شدن عملكرد و پيامدهاي درازمدت در اين بيماري است. درگيري و تورم مفاصل محيطي و انتزيت نيز يك ويژگي ديگر اين بيماري است. همچنين مي تواند به طور غيرشايع همراه با تظاهرات خارج اسكلتي ديگري مانند يووئيت حاد قدامي، نارسايي آئورت، نقايص هدايتي قلب، فيبروز لوب فوقاني ريه‌ها، درگيري نورولوژيك، آميلوئيدوز ثانويه كليه ها يا IgA نفروپاتي باشد. اين بيماري بيشترين ارتباط را با ژنتيك و به خصوص سيستم HLA داراست و ميزان اين ارتباط در جمعيت ها و نژادهاي مختلف متفاوت است. شيوع AS ارتباط نزديكي با فراواني HLA-B27 دارد كه البته اين مسئله در مورد آن دسته از ساب‌تايپ هايHLA-B27 كه با AS مرتبط هستند نيز قابل تعميم است. در ميان سفيدپوستان، شيوع تقريبيAS بر اساس معيارهاي تعديل شده نيويورك، از 68 مورد به ازاي هر 100.000 نفر، در افراد بالاي 20 سال در Netherland تا 197 نفر به ازاي هر 100.000نفر در ايالات متحده آمريكا متغير است.
به طور كلي AS در 1% تا 2% افراد بالغ داراي زيرگروه‌هاي خاصي از HLA-B27 ايجاد مي‌شود، هرچند تفاوتهاي جغرافيايي و منطقه اي در اين زمينه وجود دارد. به عنوان مثال در نروژ AS در %6.7 افراد HLA-B27 مثبت اتفاق مي افتد.در ايران شيوع HLA-B27 در افراد سالم جامعه حدود 2.5% گزارش شده است. در مطالعه COPCORD كه مطالعه اي بزرگ در جوامع روستايي و شهري بوده و بر روي 10291 نفر شهرنشين در 22 منطقه تهران و 1565 نفر روستايي در 5 روستا از منطقه تويسركان (در غرب ايران) انجام شده، شيوع AS در جوامع شهري ايران %0.12 و در جوامع روستايي كشورمان %1.1 برآورد شده است (6, 7) كه با احتساب آمار 2.5% شيوع HLA-B27 در افراد سالم جامعه ما، به نظر مي‌رسد حدود %4 افراد HLA-B27 مثبت در كشور ما به AS مبتلا مي شوند.سن شروع بيماري بيشتر در دهه سوم زندگي يعني 20 تا 30 سال بوده است. در ايران نيز متوسط سني زمان شروع بيماري در همين حدود بوده و متوسط سني بيماران 24.5 سال گزارش شده است. بنابراين، اين بيماري قشر جوان و فعال جامعه را مبتلا مي‌كند و مي تواند به آسيب قابل ملاحظه‌اي براي بيمار و اجتماع منجر شود. همچنين تعداد زيادي از بيماران دچار استئوپوروز ستون فقرات و در نتيجه شكستگي و كيفوز سينه اي مي شوند كه تمام اين ويژگي‌ها منجر به كاهش كيفيت زندگي مي‌شود. كاهش فعاليت فيزيكي بيمار به وضوح با اضطراب و افسردگي و علائم سايكولوژيك مرتبط هستند. اين بيماري بر جنبه هاي مختلف اشتغال، كار و فعاليت بيماران اثرگذار است و اين اثر مي‌تواند از نياز به كمك در محل كار تا از دست دادن شغل و از كار افتادگي متغير باشد. هزينه هاي مالي صرف شده براي بيماران نيز قابل توجه است: اين هزينه حدود 6700 تا 9500 دلار در سال براي هر بيمار مي‌باشد.با توجه به اهميت موضوع و آسيب هاي جسمي و شغلي، اجتماعي و رواني معطوف به آن، شناخت و مطالعه بر روي عوامل مستعد كننده بروز بيماري و عوامل ژنتيكي مرتبط با بيماري به پزشك كمك مي كند تا بيماراني را كه نياز به درمان شديدتري دارند زودتر شناسايي و پيش بيني نمايد تا بتواند با آمادگي بيشتر و درمان مناسب و جدي تر قبل از بروز پيشرفت بيماري و تغيير شكل و محدوديت هاي حركتي حاصل، از ايجاد اين تغييرات و عوارض تا حد امكان پيشگيري نمايد.اولين مطالعه در ايران بر روي HLA-B27 در بيماران مبتلا به AS، مربوط به دواچي، نيك بين و همكاران در سال 1977 مي باشد كه 92% از 25 بيمار AS قطعي مورد مطالعه، HLA-B27 مثبت بوده‌اند (در مقايسه با 2.5% از 100 نفر كنترل سالم). پس از آن، در مورد HLA-B27 و زيرگروه هاي آن در بيماران AS ايراني مطالعه اي بر روي 97 بيمار مبتلا به AS توسط نيكنام و همكارانش انجام شده است، كه حدود %69 آن‌ها HLA-B27 مثبت بودند. در اين مطالعه دو زيرگروه اصلي مرتبط با اين بيماري در ايرانيان، HLA-B2702 (%37.8 و HLA-B2705 (%66.2) تعيين گرديده است.با توجه به اين‌كه در اغلب جمعيت‌هاي دنيا بيش از 90% افراد مبتلا به اسپونديليت آنكيلوزان داراي آنتي‌ژن HLA-B27 مي‌باشند اما حدود 1% تا 2% از افرادي كه آنتي‌ژن HLA-B27 را دارند به بيماري اسپونديليت آنكيلوزان مبتلا مي‌شوند و نيز با توجه به اين‌كه، در جمعيت ايران اين آنتي‌ژن تقريبا در 69% افراد مبتلا به بيماري وجود دارد ، لذا مي‌توان به اين نتيجه رسيد كه ژن‌هاي ديگري علاوه بر HLA در ابتلا و پاتوژنز بيماري دخالت دارند كه با توجه به فراواني HLA-B27 در جمعيت بيماران ايراني، احتمالا تاثير اين ژن‌ها در جمعيت ايران بيش از ساير جمعيت‌هاي دنيا مي‌باشد. تا قبل از سال 2007 مطالعات زيادي بر روي ژن‌هاي خارج از منطقه HLA مانند IL-1A, KIR TNF-A, و CYP2D6 در جمعيت‌هاي مختلف صورت گرفته كه نتايج متناقضي داشته‌اند. در سال 2007 يك مطالعه بزرگ Genome Wide Association Study (GWAS) بر روي چهار بيماري اسپونديليت آنكيلوزان، گريوز، مولتيپل اسكلروزيس و سرطان سينه انجام شد كه ارتباط بسيار معني‌داري بين ژن‌هاي ERAP1(Endoplasmic Reticulum Aminopeptidase-1) و IL23R و اسپونديليت آنكيلوزان مشاهده شد. علاوه بر مطالعه سال 2007 مطالعات ديگر بر روي ارتباط اين بيماري با ژنتيك انجام شد كه تمامي اين مطالعات ارتباط ERAP1 با اين بيماري را اثبات كردند. مطالعاتي كه در سال 2009 بر روي اين دو ژن در كانادا، انگليس، پرتغال و چين انجام شد نشان دهنده ارتباط بيشتر ERAP1 با اسپونديليت آنكيلوزان نسبت به IL23R بود و ريسك خالص اين دو ژن بعد از HLA-B27 كه حدود 50% است، براي ERAP1 حدود 26% و براي IL23R 9% گزارش شده است. ERAP1 در سيستم ايمني داراي دو نقش شناخته شده است، كه هر دو با پاتوژنز اسپونديليت آنكيلوزان در ارتباط مي‌باشند. ERAP1 در پردازش بعضي از آنتي‌ژن‌‌هاي موجود در رتيكولوم اندوپلاسميك كه توسط MHC كلاس يك در سطح سلول عرضه مي‌شوند دخالت دارد. اغلب پروتئين‌ها در اولين مرحله توسط پروتئازوم شكسته و به اوليگوپپتيد‌ها تبديل مي‌شوند. MHC-I به پپتيدهاي 10-8 اسيد آمينه‌اي متصل مي‌شود كه طول اسيد آمينه اتصالي بر حسب نوع MHC كلاس يك متفاوت است. بيش از 15% پپتيدهاي توليد شده توسط پروتئازوم زماني كه وارد رتيكولوم اندوپلاسميك مي‌شوند مستقيماً به MHC كلاس يك اتصال مي‌يابند. انتهاي كربوكسي پپتيدهاي متصل شده به MHC كلاس يك توسط پروتئازوم توليد مي‌شود. سلول‌ها در سيتوزول و رتيكولوم اندوپلاسميك داراي آمينوپپتيدازهايي هستند كه محصولات NH2-Extended پروتئازوم را پردازش مي‌كنند. ERAP1 يكي از آمينوپپتيدازهاي داخل رتيكولوم اندوپلاسميك (ER) است كه پپتيدهايي را كه توسط پروتئازوم پردازش شده‌اند و طول آن‌ها 16-13 اسيد آمينه است و نيز NH2-Extended هستند را به پپتيدهاي 9-8 آمينواسيدي تبديل مي‌كند تا آماده ارائه به MHC كلاس يك شوند. ارتباط قوي بين HLA-B27 و اسپونديليت آنكيلوزان ما را به اين جهت راهنمايي مي‌كند كه ممكن است پپتيدهايي كه توسط ERAP1 پردازش مي‌گردند توسط HLA-B27 عرضه شوند. در زماني كه در عملكرد اين ژن نقص وجود داشته باشد ممكن است پپتيد آرتريوژنيكي توليد شود كه توسط HLA-B27 در سطح سلول عرضه گردد و باعث آغاز و حتي گسترش اين بيماري شود. ERAP1 همچنين باعث جدا شدن رسپتورهاي سيتوكين‌هاي پيش‌التهابي مانند IL-1 (IL-1RII)، IL-6 (IL-6Rα) و TNF-α (TNF-RI) مي‌شود و با اين عمل در تنظيم هموستاز و كنترل پاسخ‌هاي ايمني دخالت دارد. همان‌طور كه مي‌دانيم بيماري اسپونديليت آنكيلوزان يك بيماري التهابي مزمن است كه پاتوژنز آن بيشتر به سيتوكين‌هاي پيش‌التهابي مانند TNF-α، IL-1 و IL-6 ارتباط دارد. جدا شدن
IL-1RII و تبديل آن به فرم محلول sIL-1RII توسط اين پروتئين موجب اتصال اين رسپتور به IL-1 موجود در سرم و كاهش غلظت فرم آزاد اين سيتوكين و در نتيجه كاهش فعاليت بيولوژيكي اين سيتوكين التهابي مي‌شود. علاوه بر اين sIL1RII به پيش‌سازIL-1β متصل مي‌شود و از اتصال كاسپاز 1 كه تبديل كننده آن به فرم فعال است جلوگيري مي‌كند. هر گونه نقص در عملكرد اين پروتئين موجب اختلال در عملكرد پروتئين و افزايش ميزان التهاب مي‌گردد. TNF-α يك سيتوكين با عملكرد بسيار متنوع است كه اعمال آن شامل التهاب، تنظيم پاسخ ايمني، سايتوتوكسيسيتي، تنظيم بيان ژن‌ها و فعاليت‌هاي ضد ويروسي مي‌باشد و القاي اعمال بيولوژيكي آن توسط دو رسپتورTNF-RI و TNFRII صورت مي‌گيرد. TNFRI كه داراي بيشترين اهميت در القاي اثرات TNF-α است توسط ERAP1 از سطح سلول جدا مي‌گردد و به شكل محلول sTNFRI تبديل مي‌شود. sTNFRI با TNFRI در اتصال به TNF-α رقابت مي‌كند و در نتيجه باعث كاهش فعاليت بيولوژيك TNF-α مي‌شود و با ريزش از سطح سلول از تعداد رسپتورهاي سطح سلول كم مي‌شود. sTNFRI به TNFα متصل مي‌شود و به عنوان منبع TNF-α عمل مي‌كند و در صورتي كه ميزان TNF-α در خون كاهش يابد TNF-α را آزاد مي‌كند. تاكنون حدود 35 پلي‌مورفيسم تك‌نوكلئوتيدي در اين ژن مورد مطالعه قرار گرفته است كه تعدادي از آن‌ ها در جمعيت‌هاي مختلف با بيماري اسپونديليت آنكيلوزان در ارتباط بوده‌اند. اين پلي‌مورفيسم‌هاي تك‌نوكلئوتيدي با تنظيم بيان ژن، سنتز و فعاليت پروتئين در ارتباط هستند.اين مطالعه قصد دارد ارتباط ژن ERAP1 را با اين بيماري در 12 پلي‌مورفيسم تك‌نوكلئوتيدي بررسي كند كه به نظر مي‌رسد اين پلي‌مورفيسم‌ها بر روي عملكرد و بيان ژن تاثيرگذار باشند. همچنين بر اساس فراواني پلي‌مورفيسم‌هاي تك‌نوكلئوتيدي در جمعيت مورد مطالعه (گروه بيمار و كنترل) عملكرد ژن را بر اساس SNPهاي هوموزيگوت مستعد كننده و حفاظت كننده مورد بررسي قرار دهد. در اين مطالعه همچنين ارتباط HLA-B27 و زيرگروه‌هاي آن با اين بيماري در بيماران و گروه كنترل مورد بررسي قرار مي‌گيرد و نيز ارتباط SNPهاي مختلف ژن ERAP1 با HLA-B27 و زيرگروه‌هاي آن مورد بررسي قرار خواهد گرفت. همچنين در اين مطالعه ارتباط ژن ERAP1, HLA-B27 و HLA-B27 Subtypes با شدت بيماري بررسي خواهد شد.
اهداف و فرضيات :اهداف اصلي طرح1. بررسي نقش ERAP1 در ايمونوپاتوژنز بيماري اسپونديليت آنكيلوزان.2. تعيين ارتباط HLA-B27 و زيرگروه‌هاي آن با شدت بيماري در مبتلايان به اسپونديليت آنكيلوزان.3. تعيين پلي‌مورفيسم‌هاي ژن ERAP1 در گروه بيمار و كنترل.
اهداف فرعي طرح:1. بررسي رابطه HLA-B27 با SNPهاي مختلف ژن ERAP1.2. بررسي رابطه زيرگروه‌هاي مختلف HLA-B27 با SNPهاي مختلف ژن ERAP1.3. تعيين فراواني HLA-B27 و زيرگروه‌هاي آن در بيماران و گروه كنترل.4. تعيين رابطه HLA-B27 و زيرگروه‌هاي آن با تظاهرات و عوارض خارج مفصلي و نيز شدت بيماري اسپونديليت آنكيلوزان.5. تعيين هاپلوتيپ‌هاي محافظت ‌كننده و مستعد كننده در بيماران و گروه كنترل.6. تعيين همبستگي بين SNPهاي مختلف ژن ERAP1 و مشخص كردن SNPهاي Tagger.7. تعيين رابطه SNPهاي ژن ERAP1 با شدت بيماري.8. مقايسه سطح سرمي sTNF-RI, sIL-1RII, sIL-6Rα در گروه بيمار و كنترل. 9. مقايسه سطح سرمي sTNF-RI, sIL-1RII, sIL-6Rα در ژنوتيپ‌هاي هوموزيگوت SNP مستعد كننده. 10. مقايسه سطح سرمي sTNF-RI, sIL-1RII, sIL-6Rα در ژنوتيپ‌هاي هوموزيگوت SNP محافظت كننده. 11. تعيين ارتباط سطح سرمي sTNF-RI, sIL-1RII, sIL-6Rα با شدت بيماري اسپونديليت آنكيلوزان.12. مقايسه سطح سرمي IL-1α, IL-1β, IL-6 و TNF-α در گروه بيمار و كنترل.13. تعيين رابطه سطح سرمي IL-1α, IL-1β, IL-6 و TNF-α با شدت بيماري اسپونديليت آنكيلوزان.14. تعيين رابطه سطح سرمي رسپتورهاي سيتوكين‌هاي محلول sTNF-RI, sIL-1RII, sIL-6Rα با شاخص‌هاي التهاب و با يكديگر.15. تعيين ارتباط سيتوكين‌هاي IL-1α, IL-1β, IL-6 و TNF-α با شاخص‌هاي التهاب و با يكديگر.16. مقايسه بيان ژن ERAP1 در بيماران و گروه كنترل .17. مقايسه بيان ژن ERAP1 در ژنوتيپ‌هاي هوموزيگوت SNP مستعد كننده.18. مقايسه بيان ژن ERAP1 در ژنوتيپ‌هاي هوموزيگوت SNP محافظت كننده.19. تعيين ارتباط بيان ژن ERAP1 با شدت بيماري در ژنوتيپ‌هاي هوموزيگوت SNP مستعد كننده.20. تعيين ارتباط بيان ژن ERAP1 با شدت بيماري در ژنوتيپ‌هاي هوموزيگوت SNP محافظت كننده.21. مقايسه بيان sTNF-RI, sIL-1RII, sIL-6Rα در بيماران و گروه كنترل.22. تعيين رابطه sTNF-RI, sIL-1RII, sIL-6Rα با يكديگر و شاخص‌هاي التهابي.23. تعيين رابطه بيان sTNF-RI, sIL-1RII, sIL-6Rα با شاخص‌هاي شدت بيماري.
اهدف كاربردي طرح:1. با انجام اين مطالعه تعداد 400 نفر از بيماران به طور كامل مورد بررسي دقيق باليني و آزمايشگاهي قرار مي‌گيرند. (موارد مهم باليني كه در اين طرح بررسي مي‌شود در ذيل آورده شده است)2. در نهايت بيماراني كه در اين ژن نقص دارند و طبق آزمايش‌، فاكتورهاي التهابي در آن‌ها بيشتر است مورد توجه بيشتري از نظر كنترل التهاب قرار مي‌گيرند.3. رابطه SNPهاي ژن ERAP1 با HLA-B27 و زيرگروه‌هاي آن تعيين مي‌شود و در نهايت اين رابطه با موارد باليني بيماري آناليز مي‌شود.BASFI Age (year)BASDAI Ageat disease onset (year)BASMI Disease durition (year)BASQOL Modified Schober test (cm)BASG Lateral spinal flection (cm)TNF-α levels (pg/mL) Chest expansion (cm)Biological Drugs (TNF Blockers) Chest expansion (cm)Corticosteroids Occiput-wall distance (cm) NSAIDs ESR(mm/1st hour) Other Autoimmine Diseases CRP (mg/dL) BASDAI= Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index; BASFI= Bath Ankylosing Spondylitis Functional Index; ESR= Erytherocyte sedimentation Rate; CRP= C-Reactive Protein. TNF blockers (Infleximab, Etanercept, Adalimumab)
فرضيات يا سوالات پژوهش:1. آيا پلي‌مورفيسم‌هاي ژن ERAP1 در گروه بيمار و كنترل متفاوت است؟2. آيا HLA-B27 با SNPهاي مختلف ژن ERAP1 ارتباط دارد؟3. آيا زيرگروه‌هاي مختلف HLA-B27 با SNPهاي مختلف ژن ERAP1 ارتباط دارد؟4. آيا فراواني HLA-B27 و زيرگروه‌هاي آن در بيماران و گروه كنترل متفاوت است؟ 5. آيا HLA-B27 و زيرگروه‌هاي آن با تظاهرات و عوارض خارج مفصلي و نيز شدت بيماري اسپونديليت آنكيلوزان ارتباط دارد؟ 6. آيا هاپلوتيپ‌هاي محافظت ‌كننده و مستعد كننده در بيماران و گروه كنترل متفاوت است؟ 7. آيا بين SNPهاي مختلف ژن ERAP1 همبستگي وجود دارد؟ 8. آيا SNPهاي ژن ERAP1 با شدت بيماري ارتباط دارد؟ 9. آيا سطح سرمي sTNF-RI, sIL-1RII, sIL-6Rα در گروه بيمار و كنترل متفاوت است؟ 10. آيا سطح سرمي sTNF-RI, sIL-1RII, sIL-6Rα در ژنوتيپ‌هاي هوموزيگوت SNP مستعد كننده متفاوت است؟ 11. آيا سطح سرمي sTNF-RI, sIL-1RII, sIL-6Rα در ژنوتيپ‌هاي هوموزيگوت SNP محافظت كننده متفاوت است؟ 12. آيا سطح سرمي sTNF-RI, sIL-1RII, sIL-6Rα با شدت بيماري اسپونديليت آنكيلوزان ارتباط دارد؟ 13. آيا سطح سرمي IL-1α, IL-1β, IL-6 و TNF-α در گروه بيمار و كنترل متفاوت است؟ 14. آيا سطح سرمي IL-1α, IL-1β, IL-6 و TNF-α با شدت بيماري اسپونديليت آنكيلوزان ارتباط دارد؟ 15. آيا رسپتورهاي سيتوكين‌هاي محلول sTNF-RI, sIL-1RII, sIL-6Rα با شاخص‌هاي التهاب و با يكديگر ارتباط دارند؟ 16. آيا سيتوكين‌هاي IL-1α, IL-1β, IL-6 و TNF-α با شاخص‌هاي التهاب و با يكديگر ارتباط دارند؟ 17. آيا بيان ژن ERAP1 در بيماران و گروه كنترل سالم متفاوت است؟ 18. آيا بيان ژن ERAP1 در ژنوتيپ‌هاي هوموزيگوت SNP مستعد كننده متفاوت است؟ 19. آيا بيان ژن ERAP1 در ژنوتيپ‌هاي هوموزيگوت SNP محافظت كننده متفاوت است؟ 20. آيا بيان ژن ERAP1 با شدت بيماري در ژنوتيپ‌هاي هوموزيگوت SNP مستعد كننده ارتباط دارد؟ 21. آيا بيان ژن ERAP1 با شدت بيماري در ژنوتيپ‌هاي هوموزيگوت SNP محافظت كننده ارتباط دارد؟ 22. مقايسه بيان sTNF-RI, sIL-1RII, sIL-6Rα در بيماران و گروه كنترل رابطه دارد؟ 23. آيا sTNF-RI, sIL-1RII, sIL-6Rα با يكديگر و شاخص‌هاي التهابي رابطه دارند؟ 24. آيا بيان sTNF-RI, sIL-1RII, sIL-6Rα با شاخص‌هاي شدت بيماري رابطه دارند؟

كلمات كليدي: