Multiplex PCR و RFLP براي ژنوتايپينگ سريع ژن پلي مورفيك HFE

پژوهش در علوم پزشكي، مجله دانشگاه علوم پزشكي اصفهان

دوره 7 - شماره 4

نوع مقاله: ---- Unspecified ----
چكيده:

مقدمه: هموكروماتوز ارثي كه در واقع نوعي تجمع آهن در بدن و يكي از شايعترين بيماريهاي ارثي متابوليك محسوب مي شود، بيش از همه در نژاد قفقاز شايع است. اگرچه در بيشتر موارد، اين بيماري داراي پلي مورفيسم هموزيگوت Cys 282Tyr هستند، اما، واريانت His 63ASP ژن HFE حداقل بخشي از اين بيماران را دربرمي گيرد. در اين مطالعه ما روش جديدي بنيان نهاده ايم كه براي آناليز ژنوتايپينگ بيماران مشكوك به هموكروماتوز ارثي، تركيبي از روشهاي Multiplex PCR و RFLP بكار مي رود. روشها: واريانتهاي الليك ژن HFE در DNA ژنومي 24 بيمار شناسايي شدند. دو جفت پرايمر اختصاصي ژن HFE در يك واكنش Multiplex PCR استفاده شدند كه محصولات بدست آمده بوسيله هضم آنزيمي با دوآندونوكلئاز محدود اثر ساب تايپ شدند. با بكارگيري بافر PCR مطلوب، نسبت مناسب پرايمرها و شرايط مطلوب ترموسايكل مي توان از ايجاد محصولات PCR غيراختصاصي مي توان جلوگيري كرد. نتايج: شرايط خاص انتخابي براي Multiplex PCR –RFLP سبب تكثير يكنواخت و تكرارپذير DNA و هضم آنزيمي DNA هدف توسط وآندونوكلئازهاي محدود كننده در يك لوله مي شود كه در اين حالت انرژي و هزينه مصرف شده و نيز اشكالات احتمالي در انتقال محصول PCR به حداقل مي رسد. نتايج بدست آمده با اطلاعات حاصل از PCR استاندارد يكسان بود كه بر قابل اطمينان بودن روش پيشنهادي دلالت دارد و مي تواند در انجام ژنوتايپينگ بسيار ارزشمند باشد. بحث: روش پيشنهادي، روشي آسان و براحتي قابل انجام در آزمايشگاه تشخيص مولكولي باليني براي ژنوتايپينگ ژن پلي مورفيك HFE است.

Developing of multiplex PCR and RFLP for rapid genotyping of polymorphic HFE gene
Article Type: ---- Unspecified ----
Abstract:

Introduction: Alterations is the HEF protein compromise its function and are likely to induce the development of hereditary hemochromatosis (HH). Although most HH subjects homozygous for a Cys282Tyr polymorphism the His63Asp variant of the HFE gene accounts for a fraction of the HH. In this study, we have developed a new assay that combines a multiplex polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis for genotyping suspected HH patients. Methods: The allelic variants of the HFE gene in genomic DNA from 24 subjects were analyzed for assay validation. Two pairs of the HFE gene specific primers were pooled into a multiplex reaction whose products were subtyped by digestion with two restriction endonucleases. Employing optimized PCR buffer, primers ratio and thermocycling regimen prevented PCR products under representing, caused by preferential amplification of the shorter fragment under sub-optimal conditions. Results: The selected conditions for multiplex PCR-RFLP allowed uniform, reproducible DNA amplification and restriction endonuclease digestion of both DNA targets within one tube per sample that minimized labor and cost requirements and probability of PCR product carry-over. The results were reproducibly concordant with the data obtained by standard PCR analysis proving that the proposed method is reliable and could be of value in genotyping application. Discussion: The assay is robust and readily adaptable to the clinical molecular diagnostic laboratory.