تأثير غلظت سرم FBS بر انجماد سلول‌‌‌هاي اسپرماتوگونياي جداشده از موش نابالغ به روش MACS

Anatomical Sciences Journal (نام قديم مجله علوم تشريح ايران)

دوره 7 - شماره 28-29

نوع مقاله: ---- Unspecified ----
چكيده:

هدف: جداسازي سلول‌هاي اسپرماتوگونيا از موش نابالغ(NMRI (national medical research instituteبا روش جداسازي مغناطيسي سلولي و بررسي
تأثير غلظت(FBS(Fetal Bovine Serum بر ميزان زنده ماندن اين سلول‌ها پس از انجماد.
مواد و روش‌ها: بيضه جدا شده از موش‌‌هاي 6 روزه نژاد NMRI ابتدا در دو محيط آنزيمي مختلف قرار داده شد. ابتدا 8 تا 9 دقيقه در محيط اول حاوي آنزيم‌‌هاي كلاژناز، تريپسين و DNAseI و پس از شستشو با محيط (DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 به‌مدت10 تا 12 دقيقه در محيط دوم حاوي آنزيم‌هاي كلاژناز، تريپسين، DNaseI، هيالورونيداز و(EDTA(Ethylene Diamine Tetra acetic Acide قرار گرفت. سپس سوسپانسيون منفرد سلولي به‌دست آمد. در مرحله بعد سلول‌ها با استفاده از روش جداسازي magnetic activated cell sorting) MACS) جدا شدند. سپس درصد خلوص اين سلول‌ها به‌وسيله فلوسايتومتري مشخص شد. در مرحله انجماد، سلول‌ها به‌وسيله محيط‌هاي انجمادي حاوي محيط(KSOM(potassium simplex optimized medium به‌علاوه 10 درصد(DMSO (Dimethyl sulfoxide تكميل شده با 3 غلظت مختلف 50، 60 و 70 درصد از FBS منجمد شد كه به‌ترتيب گروه اول، دوم و سوم نام گرفت.
يافته‌‌ها: ميزان زنده ماندن سلول‌ها پس از تيمار آنزيمي 60/0±66/91 درصد و بعد از جداسازي به روش MACS ،33/0±25/95 درصد و ميزان خلوص سلول‌‌هاي جداسازي شده 20/2±79/93 درصد بود. ميزان زنده ماندن سلول‌ها پس از انجماد، در گروه اول 15/0±09/ 39 درصد و و در گروه دوم 98/6±55/85 درصد و در گروه سوم 38/1±29/90 درصد بود. اين ميزان بين گروه اول با گروه‌‌هاي دوم و سوم اختلاف معني‌داري نشان داد.
نتيجه‌گيري: نتايج نشان مي‌دهند كه افزايش دما زمان هضم بافت بيضه را در محيط آنزيمي كاهش مي‌دهد. با استفاده از آنتي‌بادي α6 اينتگرين و دانه‌‌هاي مغناطيسيDynabead ميزان بيشتري از سلول‌ها زنده مانده و با درجه خلوص بالاتري جدا مي‌شوند. همچنين بقاي سلول‌ها در محيط انجمادي حاوي 60 الي 70 درصد FBS افزايش مي‌يابد.

The Effect of FBS Concentration on Cryopreservation of Isolated Spermatogonial Cells from Neonatal Mouse by MACS Method
Article Type: ---- Unspecified ----
Abstract:

Purpose: The purpose of this study was the separation of spermatogonial cells from prepubertal NMRI mouse testis by magnetic activating cell sorting( MACS ) method and assessment of FBS concentration on surviving these cells after cryopreservation.
Materials and Methods: Testes from 6-days-old mouse removed and digested in two enzymatic mediums. first 8-9 min at medium containing collagenase trypsin and DNase and second 10-12 min in medium containing collagenase trypsin DNase hyalloronidase and EDTA and then the spermatogonial cells were isolated by ( MACS ) method. In the freezing step the cells were frozen in three medium containing DMEM/F12 medium 10% DMSO and 50% 60% and 70% FBS serum named group III.III.
Results: The viable cells obtained after enzymatic disaggregation were 91.66%±0.60% and after being isolated by MACS method were 95.25%±0.33%. The purity of the isolated cells was 93.79%±2.20%. The cells frozen in group I II and III had 39.09%±0.15 85.55%±6.98 and 90/29±1/38 % viability respectively.
Conclusion: according to the obtained results the increase of temperature at digestion step reduces the time of testicular tissue disaggregation and consequently increase viable cells. Higher viable cells and purity can be attained by using of ?6 integrin and magnetic beads. The results show that spermatogonial cells in freezing media containing 60% - 70% FBS have the highest viability after thawing.

قیمت : 20,000 ريال