كلونينگ ژن كدكننده آنتي‌ژن سطحي ويروس هپاتيت B در اشرشياكولي

مجله علوم پزشكي رازي (مجله دانشگاه علوم پزشكي ايران سابق)

دوره 14 - شماره 56

نوع مقاله: ---- Unspecified ----
چكيده:

زمينه و هدف: عفونت ويروس هپاتيت B در سراسر جهان آندميك است. حدود 350 ميليون ناقل ويروس هپاتيت B در جهان وجود دارد. حدود يك ميليون نفر در سال به دنبال عفونت ويروس هپاتيت B تلف مي‌شوند. متاسفانه دارويي كه بتواند به درمان كامل هپاتيت B بيانجامد، وجود ندارد و تنها راه جهت كنترل اپيدمي‌ها، انجام واكسيناسيون مي‌باشد. اندازه‌گيري مقدار DNA ويروسي براي شناسايي افرادي كه داراي عفونت مزمن هستند، مورد استفاده قرار مي‌گيرد، همچنين براي بررسي و پيش‌بيني سير درمان بيماري و تاثير داروهاي ضد ويروسي در رژيم‌هاي درماني كاربرد دارد. با معرفي Real-time PCR در آزمايشگاه‌هاي تشخيص طبي، اندازه‌گيري كمي DNA ويروس در نمونه‌هاي باليني به طور معني‌داري توسعه پيدا كرده است. هدف از اين مطالعه، كلونينگ و شناسايي ژن كدكننده آنتي‌ژن سطحي ويروس هپاتيت B به عنوان استاندارد خارجي است.
روش بررسي: اين تحقيق يك مطالعه توصيفي مي‌باشد. براي تكثير ژن S، ابتدا ژنوم ويروس از نمونه سرم كه از نظر
(HbsAg(Hepatitis B surface Antigen مثبت بود، استخراج شد. سپس با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي، قطعه‌اي از ژن S با روش (PCR(Polymerase chain reaction تكثير شد. براي كلونينگ ژن S از يك كلونينگ وكتور pTZ-57R(فرمنتاس) استفاده گرديد. پس از خالص‌سازي، محصول PCR به داخل وكتور پلاسميدي كلون شد و به داخل سلول مستعد E.Coli سويه TG1، ترانسفورم شد. باكتري حاوي پلاسميد نوتركيب با روشهاي مختلف از قبيل مقاومت به آنتي‌بيوتيك، PCR، برش با آنزيم‌هاي اختصاصي و در نهايت تعيين توالي، مورد بررسي قرار گرفت. براي آناليز آماري، از آزمون t و محاسبه ميانگين تعداد كلني‌هاي شمارش شده بر روي پليت‌هاي حاوي آنتي‌بيوتيك و بدون آن، استفاده گرديد.
يافته‌ها: پس از استخراج DNA ويروسي با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي، ژن S با روش PCR تكثير شد و قطعه‌اي شامل 175 جفت باز حاصل گرديد، سپس ژن S با استفاده از پلاسميد pTZ57R كلون گرديد. پلاسميد نوتركيب استخراج شد و با روش PCR و برش آنزيمي، مورد تاييد قرار گرفت. براي تاييد نهايي، پلاسميد نوتركيب تعيين توالي شد.
نتيجه‌گيري: نتايج حاصل از اين مطالعه نشان مي‌دهد كه قطعه 175 جفت‌بازي ژن S در پلاسميد pTZ57R كلون گرديده است كه مي‌توان از آن، جهت تهيه استاندارد Real-time PCR يا كنترل مثبت در آزمايش‌ها استفاده نمود.

Cloning of Hepatitis B Virus Surface Antigen(HbsAg) Encoded Gene in E.Coli
Article Type: ---- Unspecified ----
Abstract:

Background & Aim: Hepatitis B virus(HBV) infection is endemic worldwide. It is estimated every year more than 350 million people become infected with HBV(new cases) worldwide. Unfortunately, there are no satisfactory drugs to cure HBV and related diseases and the only way to control it is through vaccination. Measurements of HBV DNA levels are routinely used to identify infectious chronic carriers and to predict and monitor the efficacies of antiviral treatment regimens. The quantification of HBV DNA in clinical specimens has significantly improved with the introduction of real-time PCR into routine diagnostic laboratories. The aim of this research is to study cloning and identify hepatitis B virus surface antigen(HbsAg) encoded gene as external standard.
Material and Methods: A descriptive study was done on hepatitis B virus sufrace antigen encoded gene. Genomic DNA was extracted from HbsAg positive serum sample and amplified by PCR. The amplified segments were cloned in pTZ57R plasmid vector. After purification the PCR product was cloned in plasmid vector and transformed into susceptible E.coli(TG1 strain) cell. The bacteria containing the new combination plasmid was than evaluated for antibiotic resistance, PCR, enzyme cleavage and sequencing. The mean of colony numbers that grew in plates with and without ampicilin and also statistical analysis, T-student test was used.
Results: After extraction of viral DNA, Sgene was amplified by PCR; 175 bp fragment was generated. S gene was than cloned by PT2 57R plasmid. The new plasmid was extracted and was confirmed by enzyme cleavage and PCR. For final confirmation it underwent sequencing.
Conclusion: According to the results the 175 bP fragment of s gene was cloned into PT257R Plasmid. It can be used as external standard for real time PCR or as a positive control in laboratory.

قیمت : 20,000 ريال