طراحي روش بررسي اتصال سلولي پروتئين‌ها بر پايه اليزا قابل استفاده در ژن‌درماني برون تن

ارمغان دانش، فصلنامه علمي دانشگاه علوم پزشكي ياسوج

دوره 21 - شماره 4

نوع مقاله: Original Article
چكيده:

مقدمه: يكي از راه­كارهاي بهبود ژن درماني، هدفمند كردن ژن  درمانگر مي­باشد. افزودن توالي­هاي كد كننده پپتيدها و يا پروتئين­هايي كه گرايش بالايي به سلول­هاي هدف دارند به ژن­ درمانگر كد كننده پروتئين ترشحي از جمله اين روش­ها محسوب مي­شود. با اين وجود ارزيابي كارآمدي چنين تغييراتي در هدفمنسازي محصول ژن با روش­هاي معمول بررسي اتصال سلولي پروتئين­هاي درمانگر توليد شده در سيستم پروكاريوتي، بطور مستقيم امكانپذير نيست. در تحقيق پيش رو ما با طراحي روشي بر مبناي آزمون اليزا امكان بررسي اتصال سلولي پروتئين­­­هاي حاصل از ژن درماني را بطور مستقيم مورد بررسي قرار داديم.
مواد و روش­ها:بمنظور هدفمندسازي ژن درمانگر Mda-7، با روش مهندسي ژنتيك، توالي كد كننده پپتيد RGD4C  -كه گرايش زيادي به اينتگرين­هاي سطحي سلول­هاي سرطاني دارد- را در ست بعد از توالي پپتيد نشانه مصنوعي و در ناحيه كد كننده انتهاي آمين پروتئين تعبيه كرديم. سپس اين cDNA تغيير يافته و cDNA بدون تغيير را در ناقل بياني يوكاريوتي pCDNA3.1 همسان­سازي كرديم. ناقل­ها را در رده سلولي HEK-293 ترانسفكت كرديم. سپس ميزان بيان Mda-7 ترشح شده در محيط كشت سلول­ها را با آزمون اليزا سنجيديم. پس از همسان­ كردن غلظت پروتئينMda-7  و RGD.Mda-7 در محيط­هاي كشت سلول­هاي ترانسفكت شده، از آنها به عنوان منبع اين پروتئين­ها  استفاده كرديم. كاهش غلظت محصول اين ژن­ها دو ساعت پس از مجاورت با رده­هاي سلولي داري اينتگرين­  HepG2، M21 و فاقد اينتگرين Saos-2  با روش اليزا بررسي و مقايسه شد. اين آزمايش سه مرتبه بطور مستقل انجام گرفت و سپس داده­ها با آزمون آماري مقايسه ميانگين (T-Test) توسط نرم افزار SPSS، مورد تحليل آماري قرار گرفت.
نتايج و بحث:بررسي آماري نتايج، حاكي از اين است كه محصول ژن RGD.Mda-7 نسبت به محصول ژن Mda-7  جهت اتصال به سلول­هاي داراي اينتگرين  HepG2 و M21 بطور معني­داري گرايش بيشتري دارد، در حاليكه جهت اتصال به رده سلولي فاقد اينتگرين Saos-2 تفاوت معني داري نداشتند. با اين نتايج بنظر مي­رسد روش طراحي شده در اين تحقيق، راه­كار مناسبي جهت ارزيابي اتصال سلولي پروتئين­ها در كاربردهاي ژن درماني باشد.

Design an ELISA based cell attachment assay for gene therapy application
Article Type: Original Article
Abstract:

Introduction: One way in improvement of gene therapy is targeting of therapeutic gene. One of these methods is Fusion of sequences which codes targeting peptides and have high affinity for target cells to the secreted protein coding gene. However efficacy assessment of such modification in targeting of fusion genes is not simply possible as used in protein therapy. We design Cell attachment assay based on elisa technique and investigate feasibility of this strategy by RGD-Mda-7 fusion gene.
Material methods: At first we designed and constructed a RGD-Mda-7 fusion gene and cloned this modified gene likewise unmodified version in to the eukaryotic expression pcDNA3.1 vector separately. Then pc-Mda-7, pc-RGD.Mda-7 in parallel pcDNA3.1 as control negative were transfected in to the Hek-293 cells separately. The supernatant of this transfected cells were used as gene product (recombinant protein) sources. Then the affinity of these recombinant proteins to the integrin (RGD targets) positive and negative cells was assessed by elisa test.
Results and conclusions: The sequencing confirmed integrity of our constructs properly. The modified RGD.Mda-7 had more affinity to the integrin positive cells compared with unmodified Mda-7. However neither modified RGD.Mda-7 nor unmodified Mda-7 had not Impressive affinity to the integrin negative cells. Altogether it seems this elisa based method is suitable strategy.

Keyword:
قیمت : 20,000 ريال