تهيه و خالص سازي آنتي بادي پلي كلونال بر عليه انسولين انساني

اسرار، فصلنامه علمي پژوهشي دانشكده علوم پزشكي و خدمات بهداشتي درماني سبزوار

دوره 9 - شماره 2

نوع مقاله: ---- Unspecified ----
چكيده:

هورمون انسولين پلي پپتيدي است دو زنجيره اي با وزن مولكولي 5.7 كيلودالتون و داراي 51 اسيد آمينه مي باشد. اين دو زنجيره توسط پيوندهاي دي سولفيدي به يكديگر متصل مي شوند. يكي از مهمترين بيماري هاي مرتبط با انسولين بيماري ديابت مي باشد كه در آن سلول ها قادر به جذب گلوكز نبوده و ميزان گلوكز خون افزايش يافته و بافت هاي بدن با كمبود انرژي مواجه مي شوند. اين عمل باعث ايجاد عوارض حاد و ديررس متعددي مي گردد. در حال حاضر جهت اندازه گيري اين هورمون از روش RLA استفاده مي شود كه اين كيت ها نيز از خارج وارد مي شود. هدف از اين تحقيق، در نهايت طراحي كيت اليزا جهت اندازه گيري انسولين مي باشد. اولين گام جهت طراحي اين كيت نيز تهيه و تخليص آنتي انسولين انساني است. كه طي مراحل زير انجام گرفت. جهت توليد آنتي بادي از خوكچه هاي هندي به عنوان ميزبان استفاده شد. پس از ايمونيزاسيون اين حيوانات با انسولين نو تركيب انساني به همراه ادجوانت، از آنها خونگيري به عمل آمد و سرم آنها نيز جداسازي گرديد. جهت ارزيابي و تشخيص آنتي انسولين توليد شده در حيوان از سه روش RIA, Dot blot وDID استفاده شد. پس از اطمينان از وجود آنتي انسولين در سرم، توسط دو مرحله تخليص يعني سولفات آمونيوم اشباع و كروماتوگرافي تعويض يوني، مولكول هاي IgG جداسازي و تخليص گرديد. جهت ارزيابي ميزان خلوص آنتي بادي از تكنيك SDS - PAGE استفاده شد. در نهايت جهت اطمينان از عدم وجود باندهاي غير اختصاصي از تكنيك وسترن بلات استفاده شد كه آنتي بادي هاي خالص شده از درجه خلوص بالايي برخوردار بود و باندهاي غيراختصاصي مشاهده نشد.

Production and purification of polyclonal antibody to human Insulin
Article Type: ---- Unspecified ----
Abstract:

Insulin is a two-chain polypeptide hormone with molecular weight of 5.7 KD, which has 51 AA. By some disulfide bounds, these two chains are connected to each other. One of the most important diseases associating insulin is diabetes. In these patients, in the absence of insulin, cells cannot absorb glucose and glucose level of blood will increase and finally body tissues encounter a great energy shortage causing different acute and chronic implications. Nowadays for measuring this hormone, RIA methods are used. The aim of this research is designing of ELISA kit for measuring of insulin and the first step in designing such kits consists of providing and purifying antibody against human insulin. In order to provide and purify polyclonal antibody to insulin some practical fulfilled as follows. For produce antibody, we immunized Guinea pigs and after immunization stages, they were bleeded and their serum was separated. In order to assess and diagnose the produce anti-insulin by these pigs, RIA, DID and Dot blot methods were used. After making sure of the presence of insulin antibody in the serum, we purified antibody with saturated ammonium sulfate and then ion exchange chromatography. Also for the assessment of the antibody purification rate, the SDS-PAGE technique was used. Finally Western Blotting technique was used to make sure that there is not any unspecified bound.